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3. DISKUSSION 102

hergestellt werden. So wurde für die Untersuchung von Metallbindungsstellen der ATPasen

aus Helicobacter pylori von Volz et al. die chemische Synthese der Oligopeptide verwendet

(Volz, et al. 1998). Dies war jedoch nur für eine vergleichsweise kleine Anzahl möglich. Eine

andere Alternative, Peptidsequenzen in größerer Anzahl zu erhalten, wurde von Yang et al.

beschrieben indem er verschiedene Protein-Hydrolysate zu Affinitäts-Untersuchungen an

Metallen untersuchte (Yang, et al. 1998). Der Vorteil dieser Methode ist, daß schon im

Protein vorhandene, natürliche Metallbindungsstellen gefunden werden können. Der Erfolg

der Methode ist jedoch stark vom verwendeten Polypeptid abhängig. Nicht alle Proteine mit

interessanten Eigenschaften stehen aber in den benötigten Mengen zur Verfügung. Außerdem

werden eine ganze Reihe "nicht-natürlicher" Peptidsequenzen nicht berücksichtigt, der His

Tag wäre mit dieser Methode wohl nicht gefunden worden. Ein weiterer Nachteil dieser

Methode ist der hohe Aufwand im Sekundär-Screening der Klone. Manchmal mögen ver-

schiedene Peptidfragmente an die gewählte Matrix binden, diese müssen getrennt und deren

Sequenz durch Proteinsequenzierung bestimmt werden. Bei der oben beschriebenen Methode

der degenerierten Oligonukleotide kann die Sequenz eines Tags durch DNA-Sequenzierung

bestimmt werden, eine Methode, die wesentlich schneller, einfacherer und preiswerter ist, als

die Proteinsequenzierung. Ebenso ist durch die Vereinzelung der Klone die Homogenität der

Peptidsequenz sichergestellt. Tabelle 2.6 zeigt, daß mit der verwendeten Technik eine hinrei-

chend gute Variation der HeliTag-Sequenzen erreicht werden konnte. Es ist auch die

statistisch erwartete Menge inaktiver Klone durch den Einbau von einem der drei Stop-

Codons in den variablen Positionen zu beobachten.

3.5.2 Screening der Peptidbibliothek auf metallbindende Sequenzen und deren

Eignung zur IMAC

Die völlige de novo Synthese eines Metallaffinitätstags mit zehn Aminosäuren erfordert theo-

retisch das Durchmustern von 10

Klonen. Da jedoch in der Realität auch Wiederholungen

gleicher Sequenzen auftreten werden, müßte ein Vielfaches dieser Anzahl untersucht werden.

Durch die Verwendung der Metallbindungsstelle der ATPase 439 aus Helicobacter pylori

konnte der Aufwand für das Screening deutlich reduziert werden.

So wurde beim Durchmustern der Peptidbibliothek eine große Anzahl (über 60 % der unter-

suchten Klone) von Peptiden gefunden, die eine Bindung an mit Ni

-beschickter Chelating

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