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5. MATERIAL & METHODEN 123

Tabelle 5.8: Beispiel für ein typisches PCR Programm

Schritt Temperatur (° C) Zeit (Min.) Zyklen

Denaturierung 95 7:00 1

Denaturierung

Anlagerung

Extension

1:00

2:00

Extension 72 7:00 1

Diese drei Schritte werden bis zu 30 mal wiederholt, wobei die jeweils neu synthetisierte

DNA ebenfalls wieder als Matrize verwendet wurde und damit im Idealfall 2

(n entspricht

der Anzahl der Zyklen) DNA Moleküle aus einem DNA Molekül erhalten werden können.

5.6.6 DNA Sequenzierung

Die DNA Sequenzierung mit den DNA-Sequenzern 377 und 373 (Perkin Elmer) basiert auf

der Methode nach Sanger. Die DNA wird wie bei der PCR erst denaturiert und nach einem

Primeranlagerungsschritt wird der zweite DNA Strang gebildet und auch in diesem Fall

werden diese Schritte 25-30 mal durchlaufen. Es gibt jedoch zwei Unterschiede zur PCR:

• Es wird nur ein Primer pro Reaktion verwendet

• Den zugegebenen dNTP´s werden im Unterschuß Didesoxyribonukleotide (ddNTP´s)

zugegeben, wobei jedes dieser ddNTP´s mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff ge-

koppelt ist. Wird nun bei der Extension des DNA Stranges ein ddNTP eingebaut, endet

die Synthese dieses Stranges. Es entsteht also ein Gemisch aus unterschiedlich langen

DNA Strängen, an deren Ende sich jeweils ein ddNTP mit einem Fluoreszenzfarbstoff ge-

koppelt befindet.

In dieser Arbeit wurde das ABI Prism Dye Terminator bzw. ABI Prism Big Dye Terminator

Kit (Fa. Perkin Elmer) verwendet. Ein üblicher Ansatz für die Sequenzierreaktion befindet

sich in Tabelle 5.9, das PCR Programm in Tabelle 5.10.

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