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5. MATERIAL & METHODEN 131

5.8 Proteinreinigung

5.8.1 Reinigung der ROL aus Pichia pastoris in synthetischem und komplexem Medium

5.8.1.1 Konzentrierung der Überstände und Dialyse

Die aus verschiedenen Kultivierungen stammenden Überstände (Schüttelkolben, Fermenter

mit synthetischem oder komplexem Medium) wurden je nach ihrem Volumen mit Rührzellen

(Volumen 50 ml oder 500 ml) bzw. einer Cross Flow Apparatur diafiltriert. Die Überstände

wurden in der Regel auf ca. 25 % reduziert und wieder auf dasselbe Volumen mit Wasser

aufgefüllt und auf 20 % reduziert. Die Proteinkonzentrate wurden dann in Dialysemembranen

(Spectra Por) überführt und mindestens 24 h, bei Kultivierungen in synthetischem Medium

auch länger, gegen demineralisiertes Wasser dialysiert. In dieser Zeit wurde mindestens

zweimal das Wasser gewechselt.

5.8.1.2 Ionenaustauschchromatographie mit SP-Sepharose

Zur Konzentration und Feinreinigung wurde die Lipase-Lösung auf eine mit SP-Sepharose

gepackte Säule aufgetragen, welche zuvor mit drei Säulenvolumen CaCl

Lösung (10 mM;

pH=5,5) äquilibriert wurde. Daraufhin wurde die Säule mit 3 Säulenvolumen CaCl

Lösung

(10 mM; pH=5,5) gewaschen, bevor die Lipase über einen linearen Gradienten aus CaCl

Lösung (10 mM; pH=5,5) und derselben Lösung zuzüglich 1 M NaCl von der Säule eluiert

wurde. Die Fraktionen, die Lipaseaktivität enthielten, wurden in der Regel gegen dH

dialysiert und lyophylisiert. Das getrocknete Protein wurde bei 4 °C gelagert.

5.8.1.3 Hydrophobic Interaction Chromatography mit Phenyl- und Butylsepharose

Die wie in Kapitel 5.8.1.2 gereinigte ROL aus synthetischem Medium wurde mittels HIC

weiter aufgereinigt. Zu diesem Zweck wurden zwei verschiedene Säulenmaterialien, Phenyl-

und Butylsepharose (beide Pharmacia) verwendet. Der bei der Ionenaustausch-

chromatographie verwendete Salzpuffer (CaCl

Lösung (10 mM; pH=5,5) mit 1 M NaCl )

konnte dabei als Auftragungs und Waschpuffer verwendet werden. Die Elution erfolgte je-

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