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3. DISKUSSION 91

Dies ist insbesondere deshalb von Interesse, da von Beer et al. eine toxische Wirkung der

Lipase in E. coli vermutet wurde (Beer 1994), auch wenn diese von Haalck et al. (Haalck, et

al. 1997) nicht bestätigt werden konnte.

Das für die ROL kodierende Gen konnte erfolgreich in beide Vektoren kloniert und in zwei

Pichia pastoris-Stämme (mit und ohne Histidin-Auxotrophie) transformiert werden.

3.1.2 Untersuchung und Variation verschiedener Transformationsmethoden in Pichia

pastoris

Bei der Transformation der Plasmide in die Hefe machte sich die extrem niedrige Transfor-

mationseffizienz negativ bemerkbar. In der Regel konnten nicht mehr als 5-10 Kolonien pro

Platte erreicht werden. Positiv war, daß durch die Verwendung von Zeocin als Selektions-

mittel, alle Antibiotika resistenten Transformanten dann auch wirklich ROL aktiv sekretier-

ten. Im Gegensatz dazu wurde für Plasmide, die das his 4 Gen zur Selektion verwenden, von

10-50 % falsch positiven Transformanten durch Rekombination des his 4 Genes vom Plasmid

in das Pichia-Genom unter Verlust der restlichen Plasmid-DNA berichtet (Higgins und Cregg

1998).

Da die niedrige Transformationseffizienz den Einsatz dieser Hefe z. B. für Zufallsmutagenese

oder gerichtete Evolution verhindert, aber auch die Expression von Wildtyp- und rational

mutierten Proteinen erschwert wurden weitere Transformations-Methoden in Pichia pastoris

untersucht. So macht die auftretende klonale Variation und die spontane Integration mehrerer

Genkopien in die Hefe das Durchmustern einer Reihe von Klonen zur optimalen Expression

erforderlich (siehe unten, (Romanos, et al. 1998)).

Die vom Hersteller (Invitrogen) angegebene Prozedur mittels Elektroporation hat neben der

niedrigen Transformationseffizienz den Nachteil, daß man die Hefe exakt bis zu einer OD

600

von 1,3 kultivieren muß. Geringe Abweichungen hierbei führten sofort zu noch weniger, häu-

fig sogar gar keinen Transformanten. Ansonsten ist die Methode jedoch gut für die Trans-

formation geeignet, da das weitere Vorgehen unproblematisch und schnell durchzuführen ist.

Die zweite Methode, ein kommerzielles Kit (Easy Comp; Invitrogen), führte ebenfalls zu

Transformanten, allerdings konnten höchstens 1-2 Kolonien pro Transformationsansatz erzielt

werden. Ein Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, kompetente Zellen einzufrieren und

diese bei Bedarf aufzutauen und zu verwenden. Die extrem niedrigen Transformations-

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