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5. MATERIAL & METHODEN 113

Zentrifugation (10 Min, 5000 U min

-1

4 °C) vom Medium abgetrennt. Die Zellen wurden in

40 ml Puffer (EDTA (100 mM) gelöst in 50 mM Tris-Puffer, pH 8,0) resupendiert und durch

2 mal 2 Minuten Behandlung mit Ultraschall lysiert. Die Suspension wurde zentrifugiert

(14000 U min

-1

, 20 Min., 4 °C) und das enstandene Pellet in 40 ml Puffer (30 µg ml

-1

DNase,

100 mM NaCL und 1 mM EDTA gelöst in 50 mM Tris-Puffer (pH 8,0)) resuspendiert und 20

Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation (Bedingungen siehe

oben) wurde das Pellet in 40 ml Puffer (0,5 % (w/v) Triton X-100, 100 mM NaCl und 1 mM

EDTA gelöst in 50 mM Tris-Puffer (pH 8,0)) resuspendiert und anschließend wieder unter

den oben genannte Bedingungen zentrifugiert. Nach erneuter Resupension im Triton-Puffer

und Zentrifugation sind die Inclusion Bodies weitestgehend von anderen Proteinen befreit.

Die Inclusion Bodies werden in 20 ml Denaturierungslösung (7 M Guanidiniumhydrochlorid

gelöst in Tris-Puffer (pH 8,5)) resuspendiert und nach Zugabe von DTT (Endkonzentration

30 mM) 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand der nachfolgenden

Zentrifugation (15000 U min

-1

, 30 Min., 4 °C) wurde in 2 l eisgekühltem Renaturierungs-

puffer (10 % (w/v) Glycerin und je 1 mM GSH und GSSG gelöst in 20 mM CaCl

-Lösung)

unter schwachem Rühren verdünnt. Nach der Inkubation für 36 h bei 10 °C wurde die Lösung

in Dialyseschläuche (MWCO:6-8000, Spectra/Por Membran, Roth) gefüllt und gegen 10 mM

CaCl

ca. 16 h bei ein- bis zweimaligen Pufferwechsel dialysiert. Die weitere Aufreinigung

der renaturierten ROL erfolgte durch Säulenchromatographie wie in Kapitel 5.8.1

beschrieben.

5.5.2.4 Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae

Zur Kultivierung der Hefe wurde YPD Medium verwendet:

YPD Pepton (20 g l

-1

), Hefeextrakt (10 g l

-1

), Glukose (20 g l

-1

)

Synthetisches Medium zur Expression von positiven Transformanten:

Synth.

Medium

Galaktose oder Glukose (20 g l

-1

), Yeast Nitrogen Base (6,7 g l

-1

AS-Mix (50 mg l

-1

), Phosphatpuffer (100 mM, pH 6.0)

Eine Einzelkolonie wurde in 15 ml synthetischem Medium mit Glukose über Nacht kultiviert

(30 °C, 225 rpm). Nach der Zentrifugation der Kultur wurde das Zellpellet in 15 ml syntheti-

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