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2. ERGEBNISSE 70

durchgeführt . Auch hier zeigte sich keine Änderung der Masse (Abbildung 2.16, Spur 3). Die

ermittelte Molmasse von ca. 30 kDa entspricht der bei der Expression in E. coli, einem

Organismus, der als Prokaryot keine Glykosylierung an exprimierten Proteinen vornimmt.

Dies führt zu dem Schluß, daß die ROL bei der Expression im Schüttelkolben nicht glykosy-

liert wird (Abbildung 2.16 Spuren 3+4).

Bei der Analyse der Banden der in synthetischem Medium kultivierten ROL zeigte sich, daß

ein Teil der Lipase glykosyliert vorlag. So konnte die Bande bei ca. 32 kDa in Abbildung

2.17, Spur 2 der glykosylierten ROL zugeordnet werden, da sie nach Behandlung der Lipase

mit Endo H verschwand (Serrano, persönliche Mitteilung). Zur Erklärung dieses Befundes

gibt es zwei Möglichkeiten: Erstens, während der gesamten Kultivierungsdauer wird ein

kleiner Teil der ROL glykosyliert, der Hauptteil jedoch nicht oder zweitens, während einer

bestimmten Phase in der Fermentation wird die ROL glykosyliert, während sie in einer

anderen (längeren) Phase nicht glykosyliert wird.

Zur Sekretion der Lipase wurde sie an den α-Faktor aus Sacchromyces cerevisiae fusioniert,

der auch in Pichia pastoris funktionell ist. Dieser wird durch eine Protease (Kex2) während

des Sekretionsvorgangs a/jointfilesconvert/483621/bgespalten.

Durch N-terminale Sequenzierung der ROL aus Pichia pastoris und E. coli konnte die

korrekte Prozessierung des α-Faktors an der Kex2 Spaltstelle bestätigt werden. Dabei konnten

auch die zwei zusätzlichen Aminosäuren, die durch Einführung der EcoRI-Schnittstelle an das

5´-Ende des ROL Gens entstanden,nachgewiesen werden. Von diesen zwei Aminosäuren ab-

gesehen, stimmen die ersten acht Aminosäuren überein und decken sich mit den Angaben aus

der Literatur (Beer 1994, Beer, et al. 1998, Kugimiya, et al. 1992).

Tabelle 2.4: Durch Proteinsequenzierung ermittelte N-termiale Sequenz der ROL

exprimiert in E. coli und P. pastoris

Lipase -2 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

ROL (E. coli) - - SDGGKVVA

ROL (P. pastoris)E F S D G G

KVVAAT

Bei der Bestimmung der Aminosäuresequenz konnte an dieser Position nicht zweifelsfrei zwischen G und L

unterschieden werden. Die DNA-Sequenz legt jedoch nahe, daß es sich um ein G handelt.

Der isoelektrische Punkt wurde anhand der Aminosäuresequenz auf 8,3 berechnet

(Bornscheuer, et al. 1999). Die isoelektrische Fokussierung ergab bei beiden Lipasen einen

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