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1. EINLEITUNG 24

Folglich wurden von Scheib et al. der Austausch von L258 gegen das kleinere Alanin, das

kleinere und polare Serin und das größere Phenylalanin vorgeschlagen. Diese Mutanten

wurden von Scheib et al. in E. coli exprimiert und auf ihre Eigenschaften bei der Hydrolyse

der Triacylglycerin Analoga untersucht (für eine detaillierte Beschreibung des Molecular

Modellings, der Produktion der Mutanten und deren Umsetzung siehe (Scheib, et al. 1999,

Scheib, et al. 1998).

1.1.5.3 Klonierung und Expression von Rhizopus Lipasen

Einige Lipasen aus Rhizopus sp. sind kommerziell erhältlich, wie beispielsweise die von

Rhizopus niveus (Amano N), Rhizopus delemar (Amano D) und Rhizopus javanicus (Amano

J). Diese Präparationen enthalten aber häufig einen Lipasegehalt von weniger als 5 %. Aus

diesem Grund wurden in der Vergangenheit verschiedene Lipase-Gene von Vertretern der

Rhizopus sp. Familie in einen heterologen Wirt kloniert (siehe Tabelle 1.1). Dabei stellte es

sich heraus, daß alle bisher untersuchten Lipasen dieser Familie als PrePro-Enzyme vorliegen.

Das Auftreten einer Pro-Sequenz ist bei mikrobiellen Lipasen unüblich, tritt jedoch bei allen

bisher untersuchten Lipasen aus der Familie der Mucorales auf. Sie scheint mindestens zwei

Funktionen zu besitzen.

Erstens scheint es so, daß die Pro-Sequenz als Zymogen wirkt, also die Zelle vor der schädi-

genden Wirkung des aktiven Enzyms schützt, im Fall der ROL möglicherweise vor deren

Phospholipaseaktivität. Untypisch für ein Zymogen ist jedoch, daß auch die Pro-Lipase

Lipaseaktivität besitzt (Beer, et al. 1996). Bemerkenswert ist außerdem, daß die Pro-Lipase

völlig andere Eigenschaften zeigt, als die reife Lipase. Neben physikalischen Eigenschaften,

wie dem isoelektrischen Punkt und dem Schmelzpunkt unterscheiden sich z. B. die pH-

Optima um 0,5 Einheiten, außerdem unterscheidet sich das pH-Profil deutlich. Bei der

ProROL fällt die Aktivität in der Nähe des Optimums gegenüber der ROL wesentlich steiler

ab (Beer, et al. 1998, Beer et al., 1994). Bei der Temperaturstabilität verhält es sich genau

umgekehrt, hier fällt die Aktivität der ROL sehr viel stärker ab, als die der ProROL.

Zweitens scheint die Pro-Sequenz eine wichtige Rolle bei der Proteinfaltung zu spielen, hier-

bei insbesondere bei der korrekten Faltung der Disulfidbrücken.

Klone aus der cDNA Bank von Rhizopus delemar und Rhizopus oryzae, exprimiert in

Escherichia coli, zeigten eine schwache Lipaseaktivität auf Tributyrin-Platten. Genauere

Untersuchungen mit SDS-PAGE und Immunoblotting zeigten jedoch zwei Banden, die der

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