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5. MATERIAL & METHODEN 117

geerntet und bei 1500 x g 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde in

der selben Menge eisgekühltem Wasser resuspendiert, zentrifugiert (1500 x g), in 250 ml eis-

kaltem Wasser resuspendiert, erneut zentrifugiert, in 20 ml eiskalter Sorbitol-Lösung (1 M)

resuspendiert, nochmals zentrifugiert und zum Schluß in 1 ml eiskalter Sorbitol-Lösung (1 M)

aufgenommen. Die kompetenten Zellen (80 µl) wurden mit 5-10 µg der linearisierten DNA,

gelöst in 5-10 µl dH

O, gemischt und in eine auf Eis stehende Elektroporationsküvette über-

führt. Im Folgenden wurde der Transformationsansatz in der Küvette 5 Min. auf Eis inkubiert

und anschließend in einem Elektroporator (Bio-Rad GenePulser) transformiert (Spannung:

1500 V, Kapazität: 25 µF, Widerstand 200 Ω). Sofort nach dem Puls wurde 1 ml eiskaltes

Sorbitol (1 M) in die Küvette gefüllt, der Transformationsansatz in ein steriles Plastikgefäß

überführt und ohne Schütteln inkubiert (1 h, 30 °C). Die Zellen wurden auf YPDS-Platten

(YPD + 1 M Sorbitol) mit Zeocin (100 µg ml

-1

) ausplattiert und 3-4 Tage bei 30 °C inkubiert.

5.5.2.10 Transformation von Pichia pastoris durch Elektroporation nach einer vereinfachten

Variante

YPD Medium (200 ml in einem 2000 ml Kolben) wurde mit zwei Impfösen Pichia pastoris

direkt von einer YPD-Platte angeimpft und über Nacht inkubiert. Nach der Zentrifugation

(1500 x g, 10 Min, 4 °C) wurde das Pellet zweimal in 200 ml dH

O und einmal in 120 ml

Sorbitol-Lösung (1 M) resuspendiert und anschließend zentrifugiert (1500 x g, 4 °C).

Daraufhin wurde das Pellet, abhängig von der OD

600

der Ausgangskultur in Sorbitol-Lösung

(1 M) resuspendiert (1 ml Sorbitol-Lösung je 1,3 OD

600

-Einheiten). Anschließend wurde wie

in Kapitel 5.5.2.9 beschrieben vorgegangen.

5.5.2.11 Transformation von Pichia pastoris mit dem Easy Comp Kit

YPD Medium (10 ml) wurde mit einer Einzelkolonie Pichia pastoris angeimpft und über

Nacht bei 30 °C kultiviert. Die Übernachtkultur wurde auf eine OD

600

von 0,1 verdünnt, 10

ml entnommen und bei 30 °C so lange inkubiert, bis sie eine OD

600

von 0,6-1,0 erreicht hatte.

Im Anschluß an die Zentrifugation (500 x g, 5 Min., RT) wurde das Pellet in 10 ml der

Lösung I des Kits (Sorbitol, Ethylenglykol und DMSO, Konzentrationen und pH nicht be-

kannt) resuspendiert, erneut zentrifugiert (500 x g, 5 Min., RT) und in 1 ml Lösung I re-

suspendiert. Die nun kompetenten Zellen wurden in 50 µl Portionen aliquotiert und entweder

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