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INHALTSVERZEICHNIS 7

5.5.2 KULTIVIERUNG, LAGERUNG UND TRANSFORMATION DER MIKROORGANISMEN UND

PROTEINEXPRESSION IN DEN MIKROORGANISMEN ____________________________________111

5.5.2.1 Kultivierung von Escherichia coli ________________________________________________112

5.5.2.2 Transformation von Escherichia coli durch Hitzeschock ______________________________112

5.5.2.3 Expression von ROL in Escherichia coli___________________________________________112

5.5.2.4 Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae ________________________________________113

5.5.2.5 Transformation von Saccharomyces cerevisiae______________________________________114

5.5.2.6 Kultivierung von Pichia pastoris_________________________________________________115

5.5.2.7 Bestimmung des Phänotyps von mit pPICZαA_ROL transformierten Pichia pastoris________116

5.5.2.8 Detektion von Methanol in synthetischem Medium durch GC __________________________116

5.5.2.9 Transformation von Pichia pastoris durch Elektroporation nach Invitrogen________________116

5.5.2.10 Transformation von Pichia pastoris durch Elektroporation nach einer vereinfachten Variante _117

5.5.2.11 Transformation von Pichia pastoris mit dem Easy Comp Kit___________________________117

5.5.2.12 Transformation von Pichia pastoris mit der LiCl Methode_____________________________118

5.6 ALLGEMEINE MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN ___________________119

5.6.1 ISOLIERUNG VON DNA AUS E. COLI _______________________________________________119

5.6.1.1 Schnellisolierung von Plasmid-DNA nach Birnboim & Doly (Birnboim und Doly 1979) _____119

5.6.1.2 Isolierung von DNA mit Anionentauscher-Säulen (Qia Spin-Prep) ______________________120

5.6.2 E

THANOL-PRÄZIPITATION VON PLASMID DNA ______________________________________120

5.6.3 E

LEKTROPHORETISCHE TRENNUNG VON DNA UND FRAGMENTISOLIERUNG ________________120

5.6.4 I

N-VITRO MANIPULATION AN DNA: RESTRIKTIONSVERDAU, LIGATION, BEHANDLUNG MIT

ALKALISCHER

PHOSPHATASE, KLENOW-BEHANDLUNG UND PHENOLISIERUNG ______________121

5.6.5 P

OLYMERASE KETTENREAKTION (POLYMERASE CHAIN REACTION, PCR) ___________________121

5.6.6 DNA S

EQUENZIERUNG _________________________________________________________123

5.6.7 M

UTAGENISIERUNG MITTELS PCR ________________________________________________125

5.6.7.1 Mutagenisierung am Anfang und Ende eines Genfragments____________________________125

5.6.8 M

UTAGENISIERUNG MITTELS QUIK CHANGE™ ______________________________________125

5.7 ARBEITEN MIT PROTEINEN ________________________________________128

5.7.1 PROTEINANALYSE_____________________________________________________________128

5.7.1.1 SDS-PAGE__________________________________________________________________128

5.7.1.1.1 Coomassie Färbung ___________________________________________________128

5.7.1.1.2 Silberfärbung ________________________________________________________129

5.7.1.1.3 Lipase Aktivitätstest auf SDS PAGE ______________________________________129

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