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5. MATERIAL & METHODEN 127

Tabelle 5.11: Beispiel für einen typischen Ansatz zur Mutagenese durch Quick Change

Komponente Volumen

10 x Puffer 10 µl

DNA 0,5 µl (ca. 100 ng)

Primer 1 (5 pmol µl

-1

) 2,5 µl

Primer 2 (5 pmol µl

-1

) 2,5 µl

dNTP´s2 µl

(Turbo) - Pfu-Polymerase 1 µl

O 71,5 µl

Endvolumen 100 µl

Tabelle 5.12: Beispiel für ein Quick Change Programm im Thermocycler

Schritt Temperatur (° C) Zeit (Min.) Zyklen

Denaturierung 95 0:30 1

Denaturierung

Anlagerung

Extension

0:30

1:00

9:00

Extension 68 9:00 1

Die Extensionszeit ist von der Größe des Plasmids abhängig, ungefähr 2 Minuten pro kb

Die DpnI verdaute DNA wird dann in Epicurian coli XL1-Blue (Stratagene) transformiert.

Die eingefrorenen Zellen wurden langsam im Eisbad aufgetaut und die mit DpnI verdaute

DNA zugegeben. Nach vorsichtiger Durchmischung wurden die Zellen 30 Minuten mit der

DNA auf Eis inkubiert und 45 s bei 42 °C einem Hitzeschock ausgesetzt. Die Reaktions-

mischung wurde 2 Minuten auf Eis inkubiert und 0,5 ml LB-Medium zugegeben. Nach Inku-

bation für 1 h (37 °C) wurde der Ansatz kurz zentrifugiert, etwa 500 ml Überstand a/jointfilesconvert/483621/bge-

nommen und die resuspendierten Zellen auf LB-Platten mit Ampicillin (100 µg ml

-1

) aus-

plattiert.

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