Bosch PPS8 C2 Series Manual de usuario Pagina 125

  • Descarga
  • Añadir a mis manuales
  • Imprimir
  • Pagina
    / 153
  • Tabla de contenidos
  • MARCADORES
  • Valorado. / 5. Basado en revisión del cliente
Vista de pagina 124
5. MATERIAL & METHODEN 124
Tabelle 5.9: Zusammensetzung einer typischen Sequenzierreaktion
Komponente Volumen
DNA Sequenzierkit (Polymerase, Puffer,
dNTP´s, ddNTP´s)
4 µl
DNA 4 µl (200 500 ng)
Primer (1 pmol µl
-1
)4 µl
dH
2
O8 µl
Endvolumen 20 µl
Tabelle 5.10: Programm zur Vervielfältigung von DNA zur DNA Sequenzierung
Schritt Temperatur (° C) Zeit (Min.) Zyklen
Denaturierung 95 6:00 1
Denaturierung
Anlagerung
Extension
95
55
72
0:40
0:30
4:00
25
Extension 72 6:00 1
Die Sequenzierreaktion (normalerweise 20 µl) wurde mit 80 µl dH
2
O vermischt und10 µl
NaAc-Lösung (3 M, pH 5,3) sowie 250 µl Ethanol (100 %, RT) zugegeben. Nach 5 Minuten
Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Proben 20 Minuten zentrifugiert (14000 Umin,
Eppendorf 5417R, 16 °C), der Überstand vom Pellet sorgfältig entfernt, das Pellet mit 250 µl
Ethanol (70 %, RT) gewaschen und nochmals 5 Minuten zentrifugiert (14000 Umin,
Eppendorf 5417R, RT). Nach Entfernen des Alkohols wurde das Pellet im Vakuum
getrocknet, bevor die DNA in 3 µl eines Gemisches (5:1) aus Formamid und EDTA (25 mM,
pH 8,0) aufgenommen und denaturiert (2 Min., 90 °C) wurde.
Die Analyse der DNA Fragmente erfolgt in einem denaturierendem Harnstoffgel. Für dieses
wurde 30 g Harnstoff (Gibco o. Roth) mit 9,0 ml 40 % (w/v) Acrylamidlösung (Acryl-
amid:Bisacrylamid =19:1), 6 ml TBE-Puffer (10 x Puffer, Gibco o. Roth) und 23,5 ml dH
2
O
vermischt und unter Rühren leicht erwärmt, bis sich der Harnstoff vollständig löste. Nach
Vista de pagina 124
1 2 ... 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 ... 152 153

Comentarios a estos manuales

Sin comentarios